導(dǎo)言：基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)（MALDI-MSI）發(fā)展至今，受到國(guó)際及國(guó)內(nèi)眾多專家學(xué)者的關(guān)注與認(rèn)可。該技術(shù)既能夠可視化呈現(xiàn)目標(biāo)化合物在組織和細(xì)胞中的二維離子密度圖，還能夠同時(shí)呈現(xiàn)眾多其它化合物的組成、相對(duì)豐度及空間分布情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本的無(wú)標(biāo)記、高通量檢測(cè)。自動(dòng)聚焦3D AP-SMALDI質(zhì)譜成像技術(shù)的橫空出世為非平面生物樣本的檢測(cè)提供了更為高效和強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，可直接用于植物葉片、花瓣等樣本表面化合物的可視化分析。自然界中，植物在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)會(huì)受到來(lái)自方方面面的威脅，如生物脅迫和非生物脅迫，其中生物脅迫包括植食性動(dòng)物以及各種病原微生物的侵害。為了面對(duì)植食性動(dòng)物這個(gè)宿敵，植物的防御手段也可謂多種多樣，其中直接防御措施就是植物在被取食時(shí)產(chǎn)生有毒的次生代謝產(chǎn)物以此傷害來(lái)侵害的植食性動(dòng)物，影響其生長(zhǎng)發(fā)育。

        2021年2月5日，德國(guó)吉森大學(xué)Bernhard Spengler教授團(tuán)隊(duì)在Analytical and Bioanalytical Chemistry上發(fā)表了名為 “3D-surface MALDI mass spectrometry imaging for visualising plant defensive cardiac glycosides in Asclepias curassavica ”的文章，研究人員利用3D表面MALDI-MSI技術(shù)，以馬利筋為研究對(duì)象，對(duì)馬利筋苷等8種強(qiáng)心苷類植物防御性物質(zhì)進(jìn)行了空間解析。結(jié)果表明，大量防御相關(guān)代謝物分布于機(jī)械損傷(模擬草食動(dòng)物攻擊) 馬利筋葉片(葉片表面高度變化達(dá)700μm)的受損傷部位。本研究充分展示了自動(dòng)聚焦AP-SMALDI質(zhì)譜成像技術(shù)的強(qiáng)大能力和潛在的適用性，能夠分析近生理狀態(tài)下植物樣品的三維表面化合物分布信息。

       在分析受損傷馬利筋葉片之前，作者利用3D AP-SMALDI質(zhì)譜成像技術(shù)分析了完整葉片上強(qiáng)心苷類防御物質(zhì)的空間分布。結(jié)果表明，在完整葉片中8種強(qiáng)心苷類防御性代謝物均分布在主脈內(nèi)，即分布于無(wú)節(jié)乳汁管細(xì)胞所包含的高濃度乳汁中（圖1）。

       圖1（a）3D AP-SMALDI MSI檢測(cè)后的馬利筋葉片光學(xué)顯微圖像。（b）葉片表面激光燒蝕斑放大圖像。（c）完整馬利筋葉片3D光學(xué)顯微圖像，葉片表面高度變化高達(dá)350μm(圖示藍(lán)色到紅色表示葉片表面高度越來(lái)越高。d RG疊加的MSI圖像，馬利筋苷(m/z613.2410，[M+K]+，紅色)和二糖(m/z381.0793[M+H]+，綠色)。（e）從葉片葉脈區(qū)域獲得的質(zhì)量范圍為m/z420-620的單像素質(zhì)譜圖。MSI圖像178×178pixels，空間分辨率45μm，比例尺a、c、d為1mm、b為150μm。

       隨后作者檢測(cè)了機(jī)械損傷1小時(shí)后的馬利筋葉片，結(jié)果顯示，強(qiáng)心苷類防御性代謝物均集中分布于受損部位（圖2）。由于在葉片受損10min后其傷口處即可檢測(cè)到高濃度強(qiáng)心苷（圖3a-c），故用強(qiáng)心苷合成增多來(lái)解釋這一現(xiàn)象貌似并不合理。因此，本研究與以往研究一致認(rèn)為乳汁是一種可分配的防御物質(zhì)，即葉片受損傷后乳汁在第一時(shí)間運(yùn)輸至受傷部位，使得有毒防御化合物在損傷部位迅速富集。

       圖2（a）3D AP-SMALDI MSI檢測(cè)后的馬利筋葉片光學(xué)顯微圖像。（b）馬利筋葉片3D光學(xué)顯微圖像，損傷部位的高度差最高可達(dá)400μm。（c）RGB疊加MSI圖像，烏拉卡定(m/z569.2132，[M+K]+，紅色)、二糖(m/z365.1056，[M+Na]+，綠色)和三羥基黃酮丙二酰糖苷(m/z557.0692，[M+K]+，藍(lán)色)。（d） 烏拉卡定(m/z569.2132，[M+K]+)。（e）二糖(m/z365.1056，[M+Na]+)。（f）三羥基黃酮丙二酰糖苷單離子圖像(m/z557.0692，[M+K]+)。MSI圖像143×171 pixels，空間分辨率35μm，所有比例尺均為1mm。

       進(jìn)一步作者考察了防御代謝物不同時(shí)間點(diǎn)的積累速率，作者分別檢測(cè)了傷口間隔時(shí)間為4h50min（即葉片受損傷5h和10min后進(jìn)行檢測(cè)）和22h（即葉片受損傷24h和2h后進(jìn)行檢測(cè)）的機(jī)械損傷葉片。結(jié)果顯示，間隔時(shí)間較短的兩個(gè)傷口處強(qiáng)心苷類物質(zhì)的積累量相差不大，而間隔時(shí)間較長(zhǎng)的兩個(gè)傷口處則呈現(xiàn)出明顯的差異。葉片受損24小時(shí)后，受損部位強(qiáng)心苷類物質(zhì)明顯減少，表明該類物質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移或降解（圖3）。

       圖3（a,d）AP-SMALDI MSI檢測(cè)后葉片3D光學(xué)顯微圖像，對(duì)受傷區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，并標(biāo)出相關(guān)的時(shí)間間隔。（b,e）3D顯微圖像，葉片表面高度差分別達(dá)500μm和600μm。（c,f）RGB疊加MSI圖像calotoxin(m/z587.2250，[M+K]+，紅色)，二羥基黃酮(m/z255.0652，[M+H]+，綠色)和m/z255.2110(藍(lán)色) MSI圖像c111×111 pixels，空間分辨率45μm，f112×103 pixels，空間分辨率35μm，比例尺為1mm。

       植物有防御手段，動(dòng)物亦有捕食策略。許多植食性昆蟲通過(guò)脈切的方式來(lái)阻止植物防御。例如，捕食時(shí)昆蟲先切斷葉脈上端，使防御物質(zhì)不能再轉(zhuǎn)移并積累在下游部位。因此，作者采用3D AP-SMALDI MSI技術(shù)對(duì)脈切葉片的近心端（切口上游）及遠(yuǎn)心端（切口下游）傷口進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)心端比近心端防御性代謝物積累明顯減少，說(shuō)明脈切影響像Uscharin這類的防御性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移使其不能到達(dá)下游葉片發(fā)揮其防御作用，揭示了為什么大多數(shù)含有乳汁的植物(如馬利筋)的專門捕食者在取食葉片時(shí)采用脈切作為一種預(yù)防中毒的策略。

       圖4（a）AP-SMALDI MSI檢測(cè)前葉片表面的光學(xué)顯微圖像，葉片表面滲出乳汁的區(qū)域被紅線標(biāo)記出來(lái)。（b）葉片3D光學(xué)顯微圖像，高度差高達(dá)700μm。（c, d）RGB疊加MSI圖像Uscharin(m/z626.2189，[M+K]+，紅色)，（d）脫鎂葉綠素a(m/z909.5291，[M+K]+，紅色)。m/z771.4869(藍(lán)色)和丙二酰染料木甙(m/z557.0692，[M+K]+，綠色)是目標(biāo)化合物c、d的背景信號(hào)。MSI圖像157×171pixels，空間分辨率40μm，比例尺為1mm。

       結(jié)論：本文采用自動(dòng)聚焦3D AP-SMALDI MSI技術(shù)對(duì)馬利筋葉片中防御性代謝物進(jìn)行了精確定位，表明乳汁是植物抵御組織損傷和潛在植食性昆蟲攻擊的化學(xué)防御機(jī)制的一部分，植物葉片受損后，乳汁流向傷口的速度增加，使得防御物質(zhì)在葉片受損部位積累, 并進(jìn)一步分析了這種積累速率在時(shí)間和空間上的變化。此外，研究人員模仿昆蟲的捕食策略（脈切）來(lái)抵御這種防御機(jī)制，觀察到在切割傷口的遠(yuǎn)端有較少的有毒代謝物積累。同時(shí)，大量未識(shí)別的離子信號(hào)顯示出與強(qiáng)心苷類物質(zhì)具有相同的空間分布，表明馬利筋中存在著多種多樣的防御性物質(zhì)。因此，在MALDI 質(zhì)譜成像的背景下，以HPLC-MS作為補(bǔ)充方法的非靶向代謝組學(xué)是發(fā)現(xiàn)和研究植物與草食性昆蟲和病原菌相互作用關(guān)系的絕佳方法，與此同時(shí)，組織原位MALDI MS/MS檢測(cè)同樣有助于對(duì)未知代謝物的鑒定。